FRECUENCIA DE ALELOS MUTANTES DE TIOPURINA S-METILTRANSFERASA


INTRODUCCION

La tiopurina S-metiltransferasa (TPMT) es una enzima citosólica que metaboliza medicamentos, como la 6-mercaptopurina (6-MP), la tioguanina (TG) y la azatioprina (AZA), de uso común en la quimioterapia y las terapias inmunosupresoras . La actividad de TPMT es un buen factor predictivo de la toxicidad de estos fármacos y su efectividad en el tratamiento de la leucemia linfocítica aguda, las enfermedades autoinmunes y el trasplante de órganos sólidos. Una actividad enzimática muy baja o indetectable da como resultado una farmacocinética y farmacodinámica adversas que causan una disminución del recambio y dan como resultado mielosupresión, infecciones y tumores secundarios. Está bien establecido que la disminución de los niveles de actividad de la enzima TPMT es causada por polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en el gen TPMT. Los alelos más comunes son TPMT * 2 (rs1800462, c.280G> A), TPMT * 3A (rs1800460, c.460G> A y rs1142345, c.719A> G), TPMT * 3B (rs1800460, c.460G> A ) y TPMT * 3C (rs1142345, c.719A> G)  Estas variantes de TPMT conducen a una reducción en la actividad de la enzima TPMT, y los pacientes que son heterocigotos para un alelo mutante de TPMT tienen un riesgo intermedio de toxicidad hematológica, mientras que en los sujetos homocigóticos o compuestos heterocigotos TPMT * 3A la actividad de la enzima es muy baja o indetectable y El riesgo de toxicidad es alto. Por lo tanto, grupos independientes han sugerido una reducción de la dosis de tiopurinas o la selección de terapias alternativas en portadores de alelos mutantes para evitar efectos secundarios que pueden poner en peligro la vida debido a la toxicidad de la terapia. Sin embargo, se ha descrito que los alelos de repetición de trinucleótidos en el promotor TPMT también afectan los niveles de enzimas  y las variantes en ABCC4, un transportador de tiopurina, y también se ha documentado que varias enzimas metabólicas de tiopurina también influyen en el metabolismo de la tiopurina.


Las diferencias en las frecuencias de alelos TPMT entre los grupos étnicos se han documentado en las frecuencias de los alelos TPMT con un mínimo de 0.12% en Taiwán y 7.8% en México. El alelo TPMT * 3A es la variante más común en europeos (2-4.5%) y latinoamericanos (1.5-6.5%), mientras que en los grupos asiáticos (0.3-1.2%) y africanos (1.3-7.6%) TPMT * 3C es el alelo más frecuente. Entre las poblaciones latinoamericanas, el análisis TPMT se ha realizado en el sur (Argentina, Brasil, Colombia, Chile y Bolivia) y América del Norte (México), pero no hay datos disponibles de las poblaciones de América Central. Las poblaciones hispanas tienen un fondo genético muy complejo con alta heterogeneidad derivada de la mezcla de razas durante las conquistas, la colonización, la importación de esclavos y la migración. La contribución de los nativos americanos, caucásicos y africanos en diferentes proporciones explica la etnia muy diversa de estos grupos. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar biomarcadores moleculares que puedan ser utilizados por los médicos como herramientas de diagnóstico y pronóstico en cada una de estas poblaciones mezcladas, e incluir a las poblaciones indígenas en estos esfuerzos.


SUJETOS Y MÉTODOS

SUJETOS

Analizamos 447 sujetos de Guatemala, 270 eran niños con diagnóstico de LLA y 177 eran adultos sanos. Los oncólogos del Hospital de Oncología Pediátrica (UNOP) en la Ciudad de Guatemala establecieron el diagnóstico clínico utilizando criterios morfológicos, citoquímicos e inmunológicos estándar. Después del consentimiento informado, recolectamos saliva (Oragene, DNA-Genotek) o muestras de sangre de todos los participantes. La aprobación ética se obtuvo del Comité de Ética Médica de la Escuela de Medicina de la Universidad Francisco Marroquín, Guatemala. Los participantes se identificaron como indígenas o ladinos (mezclados), y se recopilaron datos sobre el lugar de nacimiento y los idiomas hablados de todos los padres y abuelos. Los indígenas hablan uno de los 11 idiomas que pertenecen al grupo lingüístico maya y el ladino se refiere a poblaciones mixtas (indígenas y europeas), o de ascendencia europea o africana.


SECUENCIACION DE ADN Y ANÁLISIS DE GENOTIPO

El ADN genómico se extrajo de las muestras de saliva usando el kit de purificación ORAGENE (DNA Genotek Inc. Ontario, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza y concentración de ADN se determinó por espectrofotometría. Los cebadores de PCR se diseñaron usando Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3). La secuenciación se realizó en 95 sujetos que representan casos indígenas y no indígenas, con reactivos ABI Big Dye y se realizó en un instrumento ABI 3730XL. El genotipado del SNP rs1142345 (exón 9) se llevó a cabo utilizando el ensayo TaqMan mientras que las variantes rs1800462 (exón 4) y rs1800460 (exón 6) se analizaron por secuenciación. TaqMan PCR se llevó a cabo utilizando el sistema ABI PRISM 7900. La mezcla de PCR consistió en 10 ng de ADN genómico, 0,45 uM de cada cebador (TPMTY240CF: 5'-GAAGGTTGATGCTTTTGAAGAACGA y TPMTY240CR: 5'-ACATGTCAGTGTGTATCTATGTCTCA), 0,1 uM de cada sonda, 2,5 ul de mezcla maestra TaqMan, Fied City Boster Mastermaster CA) y ddH2O hasta un volumen final de 5 ul. El protocolo de amplificación incluyó desnaturalización a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 segundos y recocido y extensión a 60 ° C durante 1 minuto. El genotipo de cada muestra se asignó automáticamente midiendo la fluorescencia específica de alelo usando el software SDS 2.2.3 para la discriminación alélica (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se genotipó un subconjunto de muestras aleatorias por duplicado para rs1142345 y la reproducibilidad fue del 100%. Para validar los resultados de TaqMan, se secuenciaron 3 muestras de cada genotipo utilizando los cebadores directo e inverso (Ex-9F: 5’-GAATCCCTGATGTCATTCTTCA, Ex9R: 5’-CATTACATTTTCAGGCTTTAGCA). La PCR se realizó con las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 min, 35 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 sy 68 ° C durante 30 s, y una extensión final a 72 ° C durante 7 min. La secuenciación se realizó utilizando un secuenciador de ADN ABI PRISM 3100 automatizado (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). PCR y secuenciación condiciones descritas a continuación también se utilizaron para la rs1800462 (exón 4) y rs1800460 (exón 6) análisis (TPMTEx-4F: 5'-CCCTCTATTTAGTCATTTGAAA, TPMYEx-4R: 5'-AAAACTTTTGTGGGGATATGG, TPMTEx-6F: 5'-GGGACGCTGCTCATCTTCT , TPMTEx6R: 5'-TTCAAACTCATAGAAGTCTAAGCTGAT).


ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El algoritmo FINNETI (http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl) se usó para probar el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) para las distribuciones de genotipos en ambos casos y grupos sanos. Para evaluar la diferencia en las frecuencias de genotipos y alelos entre poblaciones, grupos étnicos o géneros, utilizamos la prueba de Chi-cuadrado (programa Stat-Calc (EPIINFO 2005 V.3.2; Centros de Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA).


RESULTADOS

Un total de 270 niños cumplieron los criterios de diagnóstico de ALL para este estudio, 186 (69%) se mezclaron y 84 (31%) eran indígenas; 156 (58%) eran hombres, mientras que 114 (42%) eran mujeres. El grupo sano consistió en 177 adultos pertenecientes a las mismas poblaciones mezcladas (51%) e indígenas (49%), 53 (30%) de ellos eran hombres y 124 (70%) eran mujeres (Tabla 1). La mayoría de los indígenas hablan Kaqchikel, K'iche 'o Mam (83%), mientras que el resto son de Q'eqchi', Ah'chi, Q'anjob'al, Sakapulteco, Popti / Jakalteco y Tz'utujil. grupos (12%).

Tabla 1: Análisis comparativo de las frecuencias alélicas TPMT entre pacientes e individuos sanos y por etnia.

Tabla 2: Distribución mundial de los alelos TMPT más comunes en sujetos sanos.

* p <0.05 diferencias estadísticas en la distribución de los alelos mutantes entre Guatemala y estas poblaciones.

DISCUSIÓN

Se ha demostrado que los genotipos de TPMT son un biomarcador molecular importante en el pronóstico de respuesta de los medicamentos utilizados actualmente en el tratamiento de neoplasias hematológicas, enfermedades autoinmunes y trasplantes de órganos. Sobre la base de estudios de población, tres alelos representan más del 95% de las variantes TPMT clínicamente relevantes: TPMT * 2, TPMT * 3A, TPMT * 3C y los sujetos que tienen una tasa de actividad enzimática ausente o reducida de lo normal tienen mayor circulación concentraciones de drogas y son vulnerables a la toxicidad cuando se usa la dosis estándar. En los portadores de alelos TPMT funcionales y no funcionales individuales, las dosis iniciales de AZA o 6-mercaptopurina deben reducirse en un 30-70%, mientras que en los portadores de alelos homocigóticos no funcionales las dosis de fármacos de tiopurina deben reducirse 10 veces, o los pacientes deben recibir terapia alternativa (35). Por lo tanto, una prueba simple para los genotipos de TPMT puede proporcionar un biomarcador molecular importante que predice la respuesta del fármaco para tumores malignos hematológicos, enfermedades autoinmunes y trasplante de órganos (8, 41).

Para comenzar a determinar la distribución de alelos en América Central, secuenciamos el gen TPMT completo en 95 guatemaltecos, la mitad de los cuales eran pueblos indígenas, y encontramos solo alelos conocidos. Luego genotipamos los alelos TPMT * 2, TPMT * 3A, TPMT * 3B y TPMT * 3C en una cohorte de 447 ALL y sujetos sanos de Guatemala (etnias mezcladas e indígenas). El TPMT * 1 / * 3A fue el genotipo más común encontrado en Guatemala, y solo se identificó un sujeto homocigoto TPMT * 3A / * 3A (0.85%). No encontramos el TPMT * 2 / * 3A, TPMT * 2 / * 3B o TPMT * 2 / * 3C del heterocigoto compuesto, pero nuestro poder estadístico es insuficiente para descartar la presencia de portadores de TPMT * 3B / * 3C. Varios estudios han demostrado que los pacientes que son homocigotos o heterocigotos compuestos para alelos mutantes TPMT tienen un mayor riesgo de supresión severa de la médula ósea.

El análisis comparativo entre poblaciones mostró que los guatemaltecos (6.5%) exhiben una alta frecuencia del alelo TPMT * 3A similar al reportado en Bolivia y estudios independientes de la Ciudad de México (6.5%, 4.4% y 5.7%, respectivamente). Guatemala y México contienen poblaciones diversas; con una mezcla antigua y reciente entre pueblos amerindios, europeos y africanos; y ambos países tienen importantes poblaciones indígenas mayas. Aunque la población indígena ancestral vivía en una variedad de circunstancias ecológicas en una amplia franja de las Américas, los estudios antropológicos y arqueológicos demuestran que todos los mayas comparten ciertas características culturales derivadas de los olmecas (21). Estas características incluyen escritura jeroglífica maya, calendarios complejos y un conocimiento sofisticado de astronomía. Por otro lado, el estudio antropológico muestra que las poblaciones de mestizos mexicanos y guatemaltecos son principalmente una mezcla de pueblos amerindios y españoles, lo que también podría explicar las altas similitudes entre las dos poblaciones. Estas observaciones son consistentes con las frecuencias de genes que observamos entre los polimorfismos comunes en el locus TPMT dentro y entre estas poblaciones.

A pesar de la composición compleja de las poblaciones de Guatemala, TPMT * C,  variante principal en las poblaciones africanas (1.3-3.8%) y asiáticas (0.3-1.0%),  no se encontró en nuestra muestra. Estos datos indican una baja mezcla de guatemaltecos indígenas con descendientes africanos o asiáticos, por lo cual en base a los resultados obtenidos, no se respalda la hipótesis de un origen asiático reciente en la población indígena con un origen ancestral del alelo TPMT * C (3, 16). Sin embargo, se necesitaría una muestra más grande y más diversa geográficamente para confirmar este resultado. Por otro lado, las poblaciones guatemaltecas mezcladas tienen una de las tasas de riesgo de toxicidad más altas observadas para tratamientos basados ??en tiopurinas (17%, ver Tabla 1). Este porcentaje podría ser una subestimación, considerando que se han identificado al menos 20 variantes mutantes adicionales en TPMT (TPMT * 3D, * 4, * 5, * 6, * 7, * 8, * 10, * 23, * 28, etc. ) y que los SNP en otros genes, como la inosina trifosfato pirofosfohidrolasa (ITPA 94C> A) también afectan el metabolismo de la tiopurina.

En resumen, este es el primer estudio que evalúa las frecuencias de alelos variantes TPMT en poblaciones guatemaltecas. Debido a que al menos uno de cada 10 guatemaltecos tiene un alelo mutante TPMT, el genotipado podría realizarse en pacientes con neoplasias hematológicas, enfermedades inmunes y trasplantes de órganos para evitar o reducir los efectos secundarios durante los tratamientos basados ??en medicamentos con tiopurina. Además, se necesitan estudios adicionales para caracterizar e identificar polimorfismos en enzimas metabolizadoras de tiopurina adicionales en poblaciones guatemaltecas y del resto de Centroamérica.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al personal de la UNOP por hacer posible este estudio, así como a los pacientes y sus padres. Agradecemos a los Dres. Bert Gold, Kate Im, Wei Tan y Julie Sawitzke y Lisa Garland por leer el manuscrito. El trabajo fue apoyado por la Fundación Ayudame de Vivir, el Hospital de Niños St. Judes y en parte por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

ENLACE ORIGINAL

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4545520/


Escrito por: Petra Christine Müllers Ruiz

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